CRISPR精准改造原代T细胞对抗癌症
Gladstone研究所和加州大学旧金山分校（UCSF）的科学家表示，他们已经选择CRISPR-Cas9系统来强制激活人类免疫细胞中的基因，而不是对其进行编辑。研究人员称，这种被称为CRISPRa的方法能够让他们比以前更彻底、更快地发现在免疫细胞生物学中发挥作用的基因。“这是一项激动人心的突破，将加速免疫治疗研究。”Gladstone UCSF基因组免疫学研究所所长、新研究的资深作者、医学博士Alex Marson说，“这些CRISPRa实验为理解哪些基因对免疫细胞的每项功能都很重要创造了一块Rosetta Stone。反过来，这将为我们提供新的见解，了解如何通过基因改变免疫细胞，使其成为癌症和自身免疫性疾病的治疗方法。”
据报道，发表在《Science》杂志上的这项研究（“CRISPR activation and interference screens decode stimulation responses in primary human T cells”）是第一个在原代人类细胞中成功大规模使用CRISPRa的研究，原代人类细胞是直接从个人身上分离出来的细胞。
该团队激活了不同细胞基因组中的每个基因，使他们能够并行测试近20000个基因。这使他们能够快速了解哪些基因提供了最强大的杠杆来重新编程细胞功能，从而最终产生更强大的免疫疗法。
“人类T细胞对抗原刺激的反应，包括细胞因子的产生，对健康的免疫功能至关重要，并且可能在自身免疫、免疫缺陷和癌症中失调。系统地了解调节T细胞激活与功能获得和功能丧失基因扰动的调节剂，将有助于提供对疾病途径的更多见解，并为设计下一代免疫疗法提供更多机会。”研究人员写道。
“尽管CRISPR激活（CRISPRa）和CRISPR干扰（CRISPRi）筛选是在永生化细胞系中进行功能获得和功能丧失研究的强大工具，但在原代细胞类型中大规模部署它们一直具有挑战性。在这里，我们在原代人类T细胞中开发了CRISPRa和CRISPRi发现平台，并对响应刺激的细胞因子产生的功能调节因子进行了全基因组筛选。”
“我们优化了慢病毒方法，使CRISPRa机制能够高效、可扩展地输送到原代人类T细胞中。该平台使我们能够进行全基因组CRISPRa筛选，以发现细胞因子产生的调节因子。CRISPRa扰动细胞池通过荧光激活的细胞分选分离为高和低水平ow bins基于CD4+T细胞内源性白细胞介素-2（IL-2）产生水平或CD8+T细胞干扰素-γ（IFN-γ）产生水平。Hits包括近端T细胞受体（TCR）信号通路基因，表明这些成分的过度表达可以克服信号‘瓶颈’，调节刺激和细胞因子的产生。”
“使用CRISPRi的互惠全基因组功能丧失筛选检测到具有关键调节功能的hits，包括CRISPRa遗漏的一些hits。相比之下，CRISPRa还发现了可能不需要的hits，在某些情况下，在筛选条件下仅以低水平表达。核因子κ B（NF-κB）信号通路对IFN-γ产生的调节有力地证明了这一点，其中CRISPRi鉴定了所需的TCR-NF-κB信号通路（包括MALT1和BCL10）。CRISPRa选择性地检测到一组也通过 NF-kB 发出信号的肿瘤坏死因子超家族受体，包括4-1BB、CD27、CD40和OX40。”
“在我们的实验条件下，这些受体并不是单独发出信号所必需的，但在过度表达时可以促进IFN-γ。因此，CRISPRa和CRISPRi在全面发现功能性细胞因子调节因子方面相互补充。”
“阵列CRISPRa干扰验证了关键命中对CD4+和CD8+ T细胞的影响。我们还通过测量一组分泌的细胞因子和趋化因子，评估了单个CRISPRa干扰如何更广泛地重新编程IL-2和IFN-γ之外的细胞因子产生。”
“最后，我们开发了一个平台，用于合并CRISPRa扰动与原代人类 T 细胞中的单细胞RNA测序（scRNA-seq）读出（CRISPRa Perturb-seq）。我们使用CRISPRa Perturb-seq对由70个全基因组筛选命中和对照引起的单细胞状态进行深度分子表征，以揭示细胞因子产生的调节因子如何调节T细胞活化并将细胞编程为不同的刺激响应状态。”
“我们的研究证明了在原代人类T细胞中大规模汇集CRISPRa和CRISPRi的强大平台。成对的CRISPRa和CRISPRi筛选能够对可以调节细胞因子产生的基因网络进行全面的功能定位。通过阵列表型分析和汇集的scRNA-seq方法跟踪CRISPRa命中率，可以对关键筛选命中进行精确的功能表征，揭示关键干扰如何将T细胞调节到治疗相关状态。未来在原代细胞中进行的CRISPRa和CRISPRi筛选可以为改进的下一代细胞疗法确定靶点。”
近年来，Marson和他的同事们使用CRISPR的靶向剪刀从各种类型的人类免疫细胞中敲除基因，包括调节性T细胞和单核细胞。他们的研究结果已经开始阐明免疫细胞是如何被改造成更有效地对抗感染、炎症或癌症的。但他的团队知道他们仍然有所遗漏。
“敲除基因对于了解免疫细胞功能的基本原理非常有用，但只敲除基因的方法可能无法精确定位一些真正关键的基因。”Marson实验室博士后学者、这篇新论文的第一作者之一Zachary Steinhart博士说。
特别是，敲除一个基因并不能告诉你如果你让这个基因更活跃会发生什么。因此，研究人员转向了CRISPRa，即CRISPR激活的缩写。在CRISPRa中，Cas9蛋白被改变，因此不能再切割DNA。相反，科学家们可以将一种激活剂——一种分子“开启”开关连接到Cas9上，这样当它与基因结合时，就会激活它。或者，他们可以将一个阻遏物（一个“关闭”开关）连接到Cas9上，以关闭基因，从而获得类似于典型敲除方法（称为CRISPRi，用于CRISPR干扰）的结果。
T细胞是人体免疫的关键介质之一；它们不仅针对入侵的病原体，还引导其他免疫细胞增加或减少对入侵者或癌细胞的反应。这种信息传递是通过细胞因子的产生来实现的。不同类型的T细胞产生不同的细胞因子，不同的细胞因子或细胞因子混合物对免疫反应有不同的影响。
Marson说，控制T细胞因子将为在各种不同的疾病环境中重塑整个免疫反应提供新的机会。但研究人员对哪些基因控制哪些细胞因子还不完全了解。
在这项新的研究中，Marson、Steinhart和共同第一作者、医学博士Ralf Schmidt与他们的同事合作，使CRISPRa和CRISPRi能够在原代T细胞中高效工作——这是前所未有的。
“这种将CRISPRa或CRISPRi机器输送到细胞中的效率提高，对于实现全基因组实验和加速发现至关重要。”Marson解释说。
然后，研究团队使用这些方法激活或灭活了直接从多名健康志愿者中分离的人类T细胞中的近20000个基因。他们对产生的细胞进行了细胞因子产生变化的筛选，并锁定了数百个作为关键细胞因子调节因子的基因，包括一些以前从未在敲除筛选中发现的基因。
“我们的工作证明了这项技术在人类T细胞中的精确性和可扩展性。”Schmidt指出，“我们很快就了解了可以打开哪些基因来调节某些细胞因子水平的规则。”
为了治疗某些类型的癌症，为了治疗某些类型的癌症，临床医生越来越多地使用CAR-T细胞疗法，即从患者体内取出T细胞，在实验室中进行工程改造以靶向癌细胞，然后重新融合。例如，通过改变T细胞产生的细胞因子来增强T细胞的抗癌能力，可以使CAR-T细胞疗法更加有效。
“我们的新数据为我们提供了非常丰富的T细胞指导手册。”Marson说，“现在我们有了一种基本的分子语言，可以用来设计T细胞，使其具有非常精确的特性。”
Marson的实验室现在正在研究他们筛选出的一些个体基因，并致力于进一步利用CRISPRa和CRISPRi来发现控制人类免疫细胞其他关键特征的基因。
“与Gladstone-UCSF基因组免疫学研究所、创新基因组学研究所和UCSF生活治疗计划合作，我们的团队现在希望使用我们的新指导手册来创建合成基因程序，这些程序可以通过CRISPR工程化到下一代细胞免疫疗法中，以治疗多种疾病。”Marson说。